Entrega de estreptomicina al colon de rata mediante el uso de nanofibras electrohiladas

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 21503 (2022) Citar este artículo

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Las nanofibras electrohiladas cargadas con fármacos son sistemas potenciales de transporte de fármacos que pueden optimizar el tratamiento de enfermedades al tiempo que reducen el impacto en los microbios comensales. Se evaluó la viabilidad de las nanofibras de pululano cargadas con estreptomicina fabricadas a partir de un procedimiento de electrohilado verde utilizando agua como disolvente. Realizamos un estudio con ratas que incluyó un grupo tratado con nanofibras cargadas de estreptomicina (STR-F, n = 5), un grupo tratado con concentraciones similares de estreptomicina en el agua potable (STR-W, n = 5) y un grupo no tratado con estreptomicina. grupo de control tratado (CTR, n = 5). La estreptomicina se cargó con éxito en nanofibras y se administró mediante este vehículo, lo que minimizó la cantidad de fármaco liberado en el compartimento ileal del intestino. E. coli resistente a la estreptomicina ingerida colonizó hasta 106 CFU/g de heces, lo que revela un efecto selectivo de la estreptomicina incluso cuando se administra en las cantidades bajas permitidas por la administración basada en nanofibras. La secuenciación del amplicón 16S de la microbiota autóctona reveló efectos diferenciales en los tres grupos. Un aumento de Peptostreptococcaceae en el ciego de animales STR-F puede indicar que la fermentación de nanofibras promovió directa o indirectamente el crecimiento de bacterias dentro de esta familia. Nuestros resultados aclaran las propiedades relevantes de las nanofibras electrohiladas como un nuevo vehículo para la administración de antimicrobianos al intestino grueso.

Los antibióticos son cruciales para controlar y prevenir las infecciones, pero también pueden afectar a las bacterias no diana en la luz intestinal1,2,3. Los efectos negativos de las terapias antimicrobianas incluyen la interrupción de la microbiota intestinal comensal, así como el desarrollo de bacterias resistentes a los medicamentos3,4.

Los desarrollos dentro de las tecnologías de biomateriales han proporcionado portadores de fármacos avanzados, como las nanofibras, que podrían ayudar a superar los desafíos con la eficacia terapéutica de los fármacos, reducir el riesgo de desarrollar resistencia antimicrobiana5,6 y, potencialmente, minimizar el impacto en la microbiota intestinal.

Curiosamente, la administración de fármacos mediante vehículos nanoestructurados ha demostrado características relevantes, como la inhibición eficiente del crecimiento bacteriano y la liberación sostenida7. Además, los sistemas de administración de fármacos basados en polisacáridos, en particular el pululano, están atrayendo más atención ya que no son tóxicos, son estables, biocompatibles y biodegradables8,9,10,11. El electrohilado, que es un sistema simple y rápido de formación de nanofibras, está avanzando en la creación de nuevos tipos de nanoestructuras, incluidas láminas multicapa12,13, nanohíbridos14,15 y nanofibras de núcleo-envoltura14,16. Recientemente se han revisado diferentes estrategias potenciales de electrohilado para manipular los comportamientos de liberación de fármacos para mejorar el efecto terapéutico17,18. Contra el amplio uso de nanofibras electrohiladas para aplicaciones de administración de fármacos, varios sistemas basados en nanofibras electrohiladas introducidos involucran solventes orgánicos en el procedimiento de fabricación6. Aquí, utilizamos un proceso ecológico, que incluye pululano como biopolímero apto para uso alimentario y agua como disolvente. El pululano es un polisacárido lineal producido a partir del hongo Aureobasidium pullulans y consta de unidades de tipo maltotriosa, es decir, α-(1 → 6) enlazadas con (1 → 4)-α-d-triglucósidos19. Este patrón de enlace único conduce a una alta adherencia y resistencia a la tracción de pullulan20. A diferencia de muchos otros polisacáridos, el pululano se disuelve fácilmente en agua debido al bajo grado de enlaces de hidrógeno. Proporciona un buen potencial de procesamiento para formar películas y fibras y, debido a su naturaleza no higroscópica, muestra una resistencia mecánica intermolecular considerable8,19,21,22. Además, este biopolímero es un vehículo apropiado para aplicaciones de administración de fármacos debido a sus propiedades no mutagénicas, no cancerígenas, biodegradables, mucoadhesivas y citoadhesivas6,9,13.

Dado que la resistencia a los antimicrobianos es una de las mayores amenazas mundiales para la salud pública, y actualmente nos encontramos al borde de una era posterior a los antibióticos23, se prefiere la administración de antimicrobianos en sitios específicos. Los enfoques que aumentan la concentración local de antibióticos solo en los sitios donde se pretende que tengan efecto podrían ser una forma de reducir el desarrollo de resistencia a los medicamentos. Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo describir el impacto de las nanofibras de pululano cargadas con estreptomicina ingeridas en la comunidad bacteriana intestinal en ratas en comparación con la administración de estreptomicina a través del agua potable. Además, se evaluó el efecto selectivo sobre una cepa bacteriana resistente ingerida.

Los ensayos de difusión en disco, realizados por el método de Kirby-Bauer, confirmaron que la actividad antimicrobiana de la estreptomicina permaneció después de cargarla en las fibras electrohiladas. Por lo tanto, las nanofibras cargadas con estreptomicina inhibieron el crecimiento de cepas sensibles de E. coli y S. aureus (Fig. 1). En general, concluimos que la encapsulación del fármaco no afectó las propiedades antimicrobianas del fármaco. Por lo tanto, las nanofibras electrohiladas eran adecuadas para mantener el nivel terapéutico óptimo del fármaco antimicrobiano in vitro. Un estudio similar realizado con amoxicilina ha demostrado que la incrustación antimicrobiana de nanofibras no compromete la liberación y la actividad del fármaco24. Por lo tanto, las nanofibras electrohiladas pueden ser relevantes en diversas aplicaciones en el campo de la administración de fármacos.

Ensayo de difusión en disco. (a) Resultados de difusión en disco de S. aureus de pululano cargado con estreptomicina y (b) Resultados de difusión en disco de E. coli de pululano cargado con estreptomicina.

Se realizó un estudio con ratas para investigar los efectos de las nanofibras portadoras de estreptomicina en el grado de colonización de E. coli MG1655-K12 resistente a la estreptomicina. Antes de la inoculación, no se detectó resistencia de fondo a la estreptomicina o la gentamicina en las muestras fecales de estos animales (no se muestran los datos). El día 1 y el día 2 después de la inoculación, se encontraron significativamente más E. coli resistentes a la estreptomicina en muestras fecales de ratas que recibieron estreptomicina encapsulada en nanofibras (STR-F) o en agua potable (STR-W) que en el control (CTR) grupo (Fig. 2a). No se observaron diferencias entre STR-F y STR-W (Fig. 2a). Se encontraron números más altos de E. coli resistente en muestras cecales de los animales STR-W, mientras que la diferencia entre el grupo STR-F y el CTR no fue significativa (Fig. 2b, c). No se observaron diferencias en el número de E. coli resistente entre ninguno de los grupos en las muestras de colon y heces obtenidas el día 3, probablemente porque el tratamiento con estreptomicina cesó el día 2 tanto en STR-W como en STR-F.

recuentos de UFC. (a) Recuentos de UFC de E. coli por gramo de materia fecal en el día 1, día 2 y día 3; (b) Recuentos de CFU de E. coli por gramo de contenido de ciego en el Día 1, Día 2 y Día 3; (c) recuentos de UFC de E. coli por gramo de contenido de colon en el día 1, día 2 y día 3. *(P < 0,05); **(P < 0,01); *** (P < 0,001). Solo se obtuvieron cuatro muestras de CTR el día 1.

La estreptomicina, administrada en dosis de 5 g/l en el agua potable, se ha utilizado durante décadas en modelos animales para suprimir las bacterias anaerobias facultativas y, por lo tanto, permitir que las especies de proteobacterias resistentes a la estreptomicina ingeridas superen la barrera de colonización25,26,27. En el experimento actual, hemos aplicado una concentración mucho más baja (0,25 g/l) en el agua potable de las ratas STR-W en un intento de igualar la cantidad absoluta de 7 mg de estreptomicina administrada en forma de nanofibras a las ratas STR-F. Sin embargo, nuestros resultados demuestran que es posible obtener proliferación intestinal de bacterias resistentes a esta concentración 20 veces menor que el estándar actualmente aplicado.

La medición del consumo real de agua durante el experimento reveló que la estreptomicina total consumida por las ratas STR-W fue de alrededor de 12,5 mg, considerando un derrame estimado del 50 %. Como se mencionó anteriormente, la estreptomicina dosificada por nanofibras a ratas STR-F durante el experimento fue de aproximadamente 7 mg.

La concentración de estreptomicina liberada en el intestino a partir de las nanofibras se evaluó mediante ELISA del contenido intestinal de rata obtenido el día 3. Curiosamente, observamos una concentración de estreptomicina significativamente menor (P < 0,005) en las muestras ileales del grupo STR-F, como en comparación con el grupo STR-W (Fig. 3). Especulamos que las cápsulas de gelatina recubiertas comienzan a disolverse en el intestino delgado y liberan las fibras de pululano electrohiladas, que tienen propiedades mucoadhesivas9. Luego, las nanofibras de pululano se disuelven y forman una construcción mucoadhesiva gelatinosa que retiene el fármaco parcialmente a través del íleon y pasa al intestino grueso, donde se libera gradualmente más fármaco.

concentraciones de estreptomicina. Mapa de calor que refleja los niveles aproximados de estreptomicina presentes en el íleon, el ciego y el colon Los niveles de STR-W y STR-F son diferentes en las muestras de íleon (P < 0,005), mientras que los niveles en el ciego y el colon no difieren entre los dos grupos. El ensayo se saturó por encima de 50 ng/mL. La figura se realizó en GraphPas Prism como se describe en la sección de métodos.

De acuerdo con nuestras observaciones, las fibras core-shell, que se producen mediante electrohilado coaxial, han mostrado previamente una liberación sostenida exitosa de fármacos hidrofílicos como la estreptomicina28. Con respecto a las aplicaciones de administración de fármacos que utilizan nanofibras de pululano, existen varios estudios que se centran en las propiedades de disolución rápida del pululano y lo recomiendan para enfoques de administración rápida a través de la ruta bucal8,19,29,30 o para aplicaciones de apósitos para heridas6,31. Nuestros hallazgos sugieren que las nanofibras de pululano cargadas de antibiótico también son adecuadas para su distribución en el intestino grueso, debido a las propiedades mucoadhesivas del pululano disuelto.

Se realizó la secuenciación de los amplicones del gen 16S rRNA para evaluar el efecto del tratamiento con estreptomicina en la microbiota intestinal. La riqueza microbiana se redujo significativamente en las muestras fecales de los grupos STR-F (P = 0,008) y STR-W (P = 0,007), en comparación con el grupo CTR (Fig. 4). En el ciego, se observó una riqueza ligeramente mayor en el grupo CTR que en las muestras STR-F.

Riqueza microbiana en ciego, colon y heces. Las muestras se indican mediante puntos, mientras que las barras horizontales marcan los promedios. Los valores de p procedían de la prueba de permutación de la media y se muestran como: *(P < 0,05); **(P < 0,01); ***(P < 0,001).

La diversidad beta se comparó entre grupos en función de la disimilitud de Bray-Curtis y se visualizó con una escala multidimensional no métrica (NMDS). Tres grupos distintos representaron muestras STR-W, STR-F y CTR, respectivamente (Fig. 5a). En general, el tratamiento influyó más que la ubicación en el intestino, según el modelo PERMANOVA (0,27 [R2 para el grupo] frente a 0,09 [R2 para la ubicación], P = 0, prueba de permutación con 100 iteraciones). La comparación por pares de todos los grupos en cada ubicación fue significativa en todos los casos, excepto en las muestras fecales de los dos grupos tratados con STR (Fig. 5b).

Composiciones microbianas en ciego, colon y heces. ( a ) Las composiciones microbianas generales de las muestras al nivel de ASV se evaluaron con la distancia de Bray-Curtis y se visualizaron con una escala multidimensional no métrica (NMDS). (b) Una tabla para mostrar la comparación de la diversidad beta entre grupos en una ubicación y los valores P se derivan de los modelos PERMANOVA utilizando la distancia de Bray-Curtis. ( c ) Gráficos de barras que muestran la composición taxonómica de los 10 Phylum más abundantes.

Juntos, Bacteroidetes y Firmicutes constituyeron más del 99 % de los ASV identificados en muestras de ratas. Encontramos una reducción significativa de la abundancia relativa de Firmicutes y un aumento relativo correspondiente de Bacteroidetes en los grupos STR-W y STR-F en muestras de ciego, colon y heces (Fig. 5c).

A nivel de familia, se encontraron niveles más bajos de Lactobacillaceae en el ciego de animales STR-F en comparación con STR-W y CTR (Fig. 6), mientras que se observó una mayor abundancia de Peptostreptococcaceae, específicamente Romboutsia (Fig. 6) . Peptostreptococcaceae son comensales en ratas sanas32, y Romboutsia, que pertenece a la familia Peptostreptococcaceae, consta de microorganismos anaerobios adaptados para utilizar una amplia gama de carbohidratos y depende de aminoácidos y péptidos exógenos para la síntesis de proteínas33. Especulamos que los niveles más altos observados de esta especie en el grupo STR-F que en el grupo STR-W son el resultado de la fermentación de nanofibras en el colon, lo que directa o indirectamente promueve el crecimiento de bacterias dentro de esta familia. Las porciones no digeribles de las nanofibras estaban compuestas por unidades de maltotriosa conectadas por enlaces α-1,6, que son resistentes a las enzimas intestinales de los mamíferos pero están disponibles para la fermentación bacteriana en el intestino grueso34.

Diagrama de árbol que muestra la comparación de las abundancias relativas de taxones entre grupos. El nodo más grande en el centro es el reino de las bacterias. A lo largo de la rama del árbol hacia afuera, el siguiente nodo es el nivel de phylum, luego seguido por Clase, Orden, Familia y Género. El tamaño del nodo es proporcional a la abundancia relativa media en el nivel filogenético correspondiente. Un nodo está etiquetado y coloreado cuando tiene abundancias relativas significativamente diferentes (prueba de permutación) entre grupos. La figura se hizo en R como se describe en la sección "Métodos".

La estreptomicina se puede incorporar en nanofibras electrohiladas sin perder la actividad antibacteriana y, además, se puede retener con éxito a través del intestino delgado y administrarse en el intestino grueso de ratas mediante la dosificación con nanofibras encapsuladas. Nuestros resultados sugieren que las nanofibras electrohiladas representan una alternativa avanzada para el suministro de antimicrobianos al intestino grueso. Es probable que este enfoque permita la reducción de la cantidad de antibióticos necesarios para que sea eficaz y, por lo tanto, reduzca el riesgo de desarrollo de resistencia y provoque menos alteraciones en la microbiota autóctona. De hecho, se observó que la administración mediante nanofibras afecta a la microbiota de una manera diferente a la administración a través del agua potable.

Pullulan fue proporcionado amablemente por HAYASHIBARA CO., LTD (Japón). El agua se purificó utilizando un sistema de purificación de agua Milli-QPlus 185 (Millipore, Bedford, MA) con una resistividad superior a 18 MΩ·cm. Los discos estándar de estreptomicina (25 µg por disco) se adquirieron de Oxoid, Dinamarca. El hexametildisilazano (HMDS) se obtuvo de Merck (Alemania). La estreptomicina, la gentamicina, la trehalosa y RSM (leche descremada en polvo) se adquirieron de Sigma-Aldrich, Dinamarca.

Se cargó estreptomicina en nanofibras electrohiladas de pululano con concentraciones finales de 1 y 10% respectivamente (p/p; peso de estreptomicina respecto al peso del polímero). Para la encapsulación de estreptomicina en Pullulan, primero se disolvió polvo de estreptomicina en agua y luego se añadió polvo de pullulan a la solución para lograr la concentración deseada. Para preparar construcciones de estreptomicina al 1 % o al 10 % en pullulan (p/p), primero se preparó una solución de estreptomicina al 0,2 % o al 2 % (p/v) en agua con agitación ligera a 25 ℃ durante 4 h. Luego se añadió polvo de pululano para hacer una solución al 20% (p/v) de pululano en agua y se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Por ejemplo, para la fabricación de una estreptomicina al 1 % (p/p): lámina de nanofibras de pululano, se disolvió estreptomicina en agua (conc. 2 mg/ml) con agitación ligera a 25 ℃ durante 4 h. A continuación, se añadió polvo de pululano (0,2 g) a la solución de 1 ml para lograr la concentración final deseada de 20 % de pululano en agua para un electrohilado óptimo. Finalmente, la solución se filtró en condiciones estériles a través de un filtro de 25 mm (Sigma Aldrich) y se usó para electrospinning.

Para electrospinning, se utilizó un sistema de electrospinning convencional personalizado que incluye una fuente de alto voltaje (Glassman, FJ50P2.4-F22), una bomba de jeringa (Aladdin, AL-1000) conectada a una jeringa con una aguja hipodérmica de 21 G y un colector estático . Los parámetros de centrifugado optimizados se establecieron en una velocidad de alimentación de 1 ml/h, un voltaje de 14 a 16 kV, una distancia entre la punta de la aguja y el colector de 15 cm, una humedad del 35 % y una temperatura de 25 °C. La cámara de electrohilado, incluida la bomba y el colector, se desinfectó con EtOH al 70 % antes de comenzar cada procedimiento de electrohilado.

Para investigar si la eficacia de la actividad antimicrobiana de la estreptomicina permanece después del electrohilado, realizamos un ensayo de difusión en disco por el método de Kirby-Bauer35. La actividad antibacteriana de la estreptomicina cargada en láminas de nanofibras se analizó frente a Gram-negativos (Escherichia coli (E. coli) MG1655 subst. K12 (ATCC 47076)) y Gram-positivos (Staphylococcus aureus (S. aureus) (ATCC 2928)) bacterias sensibles a la estreptomicina. Las cepas de E. coli y S. aureus se cultivaron durante la noche en placas Luria Bertani (LB) a 37 °C. Se preparó un inóculo para cada muestra y se ajustó la turbidez de la suspensión en un densitómetro (Sensititre-Nephelometer, Thermo Fisher, Dinamarca) en comparación con el estándar 0,5 McFarland. Luego, se esparcieron cien microlitros del inóculo en placas de agar Mueller-Hinton. Las láminas electrohiladas que contenían 10 µg y 100 µg (de 1 y 10 % p/p de estreptomicina:nanofibras de pululano) se cortaron con un punzón de biopsia de 6 mm, luego se colocaron junto a los discos estándar de estreptomicina del mismo diámetro (25 µg) (Oxoid , Dinamarca) como control. Se incluyeron láminas electrohiladas no cargadas con estreptomicina (nanofibras de pululano) como controles negativos. Las muestras se incubaron a 35 °C durante 16 a 18 h. Se midió el diámetro de la zona de inhibición y se comparó con los valores del punto de ruptura proporcionados por las directrices EUCAST (https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Breakpoint_tables/v_11.0_Breakpoint_Tables.pdf).

Para dosificar a las ratas con nanofibras cargadas de antibióticos, las láminas electrohiladas de estreptomicina al 10 %: pululano se cortaron manualmente para formar partículas cuadradas de alrededor de 1 mm de longitud. Luego, las cápsulas de gelatina de cubierta dura (Torpac tamaño 9) se recubrieron con una solución al 12 % (p/v) de Eudragit L100 en IPA a la que se añadió sebacato de dibutilo como plastificante en una proporción del 5 % p/p con respecto a Eudragit. Finalmente, las cápsulas se llenaron con 12 mg de partículas (equivalentes a 1,2 mg de estreptomicina por cápsula) antes de administrar la dosis a las ratas.

Para averiguar si la hoja electrohilada de nanofibras cargada con estreptomicina afectó el establecimiento de bacterias resistentes a la estreptomicina en el intestino, realizamos un estudio en ratas que involucró la inoculación oral de los animales con E. coli MG1655 subst marcado con mCherry resistente a la estreptomicina. K12, identificador de taxón 511145 (https://www.uniprot.org/uniprot/A0A4D6FVK6) en asociación con estreptomicina administrada como nanofibras encapsuladas, en el agua potable o sin estreptomicina como control (Fig. 7). La cepa marcada con fluorescencia se eligió para permitir una fácil verificación por microscopía.

Esquema de estudio. Representación esquemática del estudio in vivo, que representa CTR (control), que recibió una cápsula de gelatina de cubierta dura de placebo, STR-F (nanofibras cargadas con estreptomicina), que recibió una cápsula recubierta con Eudragit 100S y cargada con partículas de pululano cargadas con antibiótico dos veces al día, y STR-W (estreptomicina en el agua potable) recibió una cápsula de gelatina de cubierta dura de placebo y estreptomicina en el agua potable (0,25 g/L). Todos los grupos recibieron una dosis única de 108 UFC de Escherichia coli resistente a la estreptomicina. La figura fue creada en BioRender por los autores.

Quince ratas macho Sprague-Dawley de 8 semanas de edad (Charles River) se distribuyeron en tres grupos de cinco y se alojaron individualmente en scantainers (Scanbur). Después de un período de aclimatación de siete días, los animales fueron tratados con estreptomicina en agua de bebida (STR-W), dentro de partículas de nanofibras electrohiladas (STR-F), o no recibieron ningún fármaco antimicrobiano (CTR). Las ratas CTR recibieron una cápsula de gelatina de cubierta dura de placebo, las ratas STR-F recibieron una cápsula de gelatina de cubierta dura llena de partículas de pululano cargadas de antibiótico como se describió anteriormente, dos veces al día durante 3 días (Día 0, 1 y 2), mientras que las Las ratas STR-W recibieron una cápsula de gelatina de cubierta dura de placebo vacía y estreptomicina en el agua de bebida (0,25 g/L) durante los mismos tres días (Fig. 7). Apuntamos a una concentración en el agua potable, que haría que el consumo total de estreptomicina por parte de las ratas STR-W coincidiera con los aproximadamente 7 mg administrados a las ratas STR-F considerando que el consumo promedio de agua fue entre ca. 30-50 mL de agua/animal/día. Para este estudio, se incubaron E. coli resistentes a estreptomicina y gentamicina en agar LB (SSI Diagnostica A/S) durante 16 h, como se describió anteriormente. Se transfirió una colonia a caldo LB suplementado con 20 µg/mL de gentamicina y 100 µg/mL de estreptomicina durante la noche/16 h a 37 °C mientras se agitaba. El cultivo se centrifugó a 5000 × g durante 10 min, se lavó y se resuspendió en solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril hasta una densidad celular de 109 CFU/mL. Veinticuatro horas después del inicio del tratamiento con estreptomicina, todos los grupos recibieron una dosis única de aproximadamente 108 CFU de la cepa. Los animales fueron alimentados y recibieron agua ad libitum durante todo el experimento.

Se recolectaron muestras fecales (aproximadamente 1 g) antes de la inoculación y 24 h, 48 h y 72 h después de la inoculación. Después de 72 h, los animales fueron sacrificados por asfixia con CO2 seguida de decapitación. Las ratas se diseccionaron y los contenidos luminales se recogieron asépticamente de las regiones del íleon distal, el ciego y el colon. Los contenidos de estas secciones fueron pesados y homogeneizados. Se extendieron diluciones diez veces mayores en placas de agar LB suplementadas con estreptomicina (100 µg/mL) o gentamicina (25 µg/mL) (Sigma-Aldrich, Dinamarca), según fuera apropiado. Los recuentos de UFC se evaluaron después de 24 a 72 h de incubación a 37 °C en condiciones anaeróbicas. Las colonias aleatorias se analizaron mediante espectrometría de masas con Bruker Reflex™ III MALDI-TOF (Bruker-Daltonik, Alemania) para garantizar que los aislamientos correspondieran a E. coli K-12 MG1655.

Para estimar la cantidad de fármaco liberado en la luz intestinal, se realizó un ensayo ELISA para verificar la concentración de estreptomicina presente en el contenido fecal. Se analizaron los sedimentos fecales del íleon, ciego y colon. Las muestras se homogeneizaron y diluyeron, y el procedimiento se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante del kit ELISA de estreptomicina SM (Elabscience, EE. UU.) (n.º de catálogo E-FS-E031). La densidad óptica (OD) se midió utilizando un lector de microplacas Biotek EL800 (Agilent, DK), ajustado a 450 nm y 630 nm. Los datos se procesaron utilizando GraphPad Prism Software 8.1.1.

La extracción de ADN, la preparación de la biblioteca y la posterior secuenciación en la plataforma Ion Torrent se realizaron como se describió anteriormente36. Brevemente, las muestras consistieron en muestras fecales a las 72 h (n = 15), muestras de íleon (n = 15) y muestras de colon (n = 15). El ADN microbiano se extrajo utilizando ~ 0,2 g de materiales con el kit de aislamiento DNeasy® PowerLyzer® PowerSoil® de Qiagen. El ADN extraído se almacenó a -20 °C antes de su uso.

La amplificación de la región V3 del gen 16S rRNA se realizó de la siguiente manera: la mezcla maestra de PCR constaba de 0,2 µL de polimerasa de ADN de alta fidelidad Phusion (ThermoFisher Scientific F-553L), 4 µL de tampón HF, 0,4 µL de dNTP (10 mM de cada base ), cebador directo 1 µM (PBU; 5ʹA-adaptador-TCAG-código de barras-CCTACGGGAGGCAGCAG-3ʹ) y cebador inverso 1 µM (PBR; 5ʹ-trP1-adaptador-ATTACCGCGGCTGCTGG-3ʹ) y 5 ng de ADN fecal comunitario en 20 µL de reacción total volumen. Ambos cebadores (TAG Copenhagen A/S) se vincularon a adaptadores de secuenciación y el cebador directo contenía además un código de barras exclusivo de 10 pb (adaptadores de código de barras Ion Xpress™) para cada muestra. El programa de PCR consistió en una desnaturalización inicial de 30 s a 98 °C, seguida de 24 ciclos de 98 °C durante 15 s y 72 °C durante 30 s y, por último, 72 °C durante 5 min para permitir la extensión final antes de enfriar a 4 °C. Se incluyeron controles sin plantilla para cada serie de PCR, todos resultaron en menos de 0,05 ng/µL. Los productos de PCR se purificaron utilizando HighPrepTM PCR Magnetic Beads (MAGBIO®, AC-60005) con un soporte magnético de 96 pocillos (MAGBIO®, MyMag 96), según las recomendaciones del fabricante. La cantidad de ADN se midió con el ensayo Qubit® dsDNA HS (InvitrogenTM, Q32851) y se secuenció en el chip con los sistemas Ion OneTouchTM e Ion PGM con un 318-Chip v2 que incorpora la química Hi-Q en ejecuciones de 200 pb.

Las secuencias sin procesar se desmultiplexaron con códigos de barras y los cebadores se eliminaron con QIIME237. Las secuencias obtenidas se filtraron adicionalmente hasta un rango de 125 a 180 pb. Estas lecturas preprocesadas se analizaron con la canalización DADA2 en R38, utilizando los parámetros recomendados para Ion Torrent. Las variantes de secuencia de amplicón obtenidas (ASV) se anotaron taxonómicamente a partir de entonces utilizando la base de datos Ribosomal Database Project (RDP) (versión 11.5).

El análisis estadístico se realizó con QIIME2, R y GraphPad Prism Software 8.1.1. Las muestras se enrarecieron a una profundidad uniforme de lecturas antes de calcular la riqueza. Los recuentos de UFC, la concentración de estreptomicina, la riqueza microbiana y la abundancia de taxones se compararon con una prueba de permutación bilateral. Los ASV (variante de secuenciación de amplicones) con abundancias relativas inferiores al 0,01 % se eliminaron antes de realizar más análisis. La diversidad beta se evaluó con base en la matriz de distancia de Bray-Curtis y se comparó con el análisis de varianza multivariante permutacional (PERMANOVA). La composición taxonómica que se muestra con los árboles se generó con R-package "metacoder"39. El nivel de significación se fijó en 0,5. La comparación de los niveles de estreptomicina evaluados por ELISA en ciegos de animales STR-F y STR-W se realizó mediante la prueba t suponiendo varianzas iguales.

La Inspección Danesa de Experimentos con Animales aprobó el ensayo con animales con el número de licencia 2020-15-0201-00484. El protocolo del experimento fue registrado previamente por BioFacility de DTU. Los animales fueron monitoreados diariamente durante el experimento, y el experimento se llevó a cabo de acuerdo con las pautas nacionales danesas y fue supervisado por el Comité de Bienestar Animal del Instituto para el cuidado y uso de los animales. Los métodos se informan de acuerdo con las pautas de ARRIVE.

Los datos de secuencia se han depositado en NCBI Sequence Read Archive con el número PRJNA758361.

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Esta investigación fue financiada por la Fundación Novo Nordisk (NNF17OC0026910), MIMIO–Microstructures, microbiota and oral delivery y por la Danish National Research Foundation (DNRF122) y la Fundación Villum (Grant No. 9301), Center for Intelligent Drug Delivery and Sensing Using Microcontainers y Nanomecánica (IDUN). Los autores agradecen a los cuidadores de animales de DTU BioF por el manejo de los animales.

Estos autores contribuyeron por igual: Priscila R. Guerra y Fatemeh Ajalloueian.

Instituto Nacional de Alimentos, Universidad Técnica de Dinamarca, 2800, Kgs. Lyngby, Dinamarca

Priscila R. Guerra, Shaodong Wei, Katja Ann Kristensen, Martin Iain Bahl y Tine Rask Licht

Departamento de Tecnología de la Salud, Universidad Técnica de Dinamarca, 2800, Kgs. Lyngby, Dinamarca

Fatemeh Ajalloueian y Anja Boisen

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PRG y FA contribuyeron al diseño del estudio, la preparación de nanofibras, el estudio in vivo, el análisis de datos y la preparación del manuscrito. KAK contribuyó al estudio in vivo, ELISA y preparación de secuenciación. SW contribuido al análisis de datos y preparación del manuscrito. MIB, AB y TRL contribuyeron al diseño del estudio, el análisis de datos y la preparación del manuscrito. Todos los autores revisaron y aprobaron el manuscrito.

Correspondencia a Tine Rask Licht.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Guerra, PR, Ajalloueian, F., Wei, S. et al. Entrega de estreptomicina al colon de rata mediante el uso de nanofibras electrohiladas. Informe científico 12, 21503 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-25769-z

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Recibido: 18 Agosto 2022

Aceptado: 05 diciembre 2022

Publicado: 13 diciembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-25769-z

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